I.
Tujuan
Mengetahui dan
memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan bakteri ke dalam kelompok
bakteri gram positif atau bakteri gram negatif serta menentukan morfologinya.
II.
Pendahuluan
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai
morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri
adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran
inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus,
basil, dan spiral, serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri
sangat bervariasi dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan. Bakteri
umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak
kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena
itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan
mikroskop (Dwidjoseputro, 2005).
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula
diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa,
salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu
teknik pewarnaan atau pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi
untuk kepentingan identifikasi bakteri. Morfologi mikroskopik mikroorganisme
yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan
gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Dengan metode pengecatan gram,
bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram
negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh
karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel. Dalam proses ini, olesan bakteri yang
sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet,
larutan iodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya
berupa safranin.
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil
ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut
akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram
negative akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur
dinding sel bakteri (Karmana, 2008).Berdasarkan hal tersebut maka dilakukanlah
agar praktikan dapat memahami dan melakukan pewarnaan gram terhadap suatu jenis
bakteri; mengidentifikasi suatu jenis bakteri gram positif atau gram negatif;
dan mengamati bentuk bakteri.
III.
Tinjauan Pustaka
A. Pewarnaan Gram
Bakteri merupakan
organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat
dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang
beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada
sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 µm. (Pelczar dan Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat
bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat
struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,
menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat
warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. (Pelczar
& Chan, 2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam
yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan
ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan
bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna
berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. (Pelczar
& Chan, 2007).
Prinsip dasar dari
pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa
aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.(Volk
dan Wheeler, 1993)
Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai
berikut :
1.
Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan zat warna yang
tunggal bertujuan untuk mengindentifikasi morfologi sel bakteri. Pada
pewarnaan ini zat warna yang kami gunakan adalah gentiana violet.Biasanya
bakteri maupuin sekitarnya akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan
intensitas yang berbeda. Pewarna sederhana yaitu tipe pewarna yang paling
sederhana, caranya hanya dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi
salah satu diantaranya zat warna berikut : Lembayung gentian, lembayung
safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin bara yang lainnya. (Pelczar
& Chan, 2007)
a.
Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat
warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang
dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
(Pelczar & Chan, 2007)
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan
basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina. (Pelczar & Chan, 2007)
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu
zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu
cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh
zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal
(10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik). (Pelczar & Chan, 2007)
2. Pewarnaan
differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan
lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram. Pewarnaan gram atau metode
gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas di
gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini di beri nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853-1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiela,
pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua
kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam
positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun
bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci
dengan alkohol dan
sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau
safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar dan Chan, 2007).
Ciri-ciri
bakteri gram negatif yaitu:
a. Struktur
dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
b. Dinding
selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam
tekoat.
c. Kurang
rentan terhadap senyawa penisilin.
d. Pertumbuhannya
tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
e. Komposisi
nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
f. Tidak
resisten terhadap gangguan fisik.
(Pelczar dan
Chan, 2007)
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
a. Struktur
dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
b. Dinding
selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
c. Bersifat
lebih rentan terhadap penisilin.
d. Pertumbuhan
dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
e. Komposisi
nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
f. Lebih
resisten terhadap gangguan fisik.
(Pelczar dan
Chan, 2007)
Dalam
pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
a.
Zat warna utama (violet kristal)
b.
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan
untuk mengintensifkan warna utama.
c.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu
solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
d.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan
untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah
perlakuan dengan alcohol. (Pelczar dan
Chan, 2007)
Penyebab terjadinya
dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi
zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding
sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang
penting; dinding sel bakteri Gram negatif
pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif.
Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram
positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan menunjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak
lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas dinding sel meningkat. Dengan demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol
dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang
hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan
bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih
sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram
posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup
besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selanjutnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dengan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa
strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga
oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan
oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram
positif itu yang
menjadi tempat pertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Karmana,
2008)
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid
yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid
dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat
pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri
Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan
mengecilkan pori‐pori
sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki
dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga
permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif
hanya memiliki 1‐2
lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih
besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, alkohol,
Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades),
Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah)
(Safranin, Alcohol, Aquades) (Pelczar
& Chan, 2007).
Perbandingan
Karakteristik Gram positif dan Gram negatif
1. Dinding
sel
a. Gram
positif : Homogen dan tebal (20-80 nm) serta sebagian besar tersusun dari
peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding
sel.
b. Gram
negatif : Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dam dan luar, serta adanya
membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan
lipopolisakarida
2. Bentuk
sel
a. Gram
positif : Bulat, batang atau filamen
b. Gram
negatif : Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand koma, heliks
atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul
3. Reproduksi
a. Gram
positif : Pembelahan biner
b. Gram
negatif : Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan
4.
Metabolisme
a.
Gram positif : kemoorganoheterotrof
b.
Gram negatif : Fototrof,
kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof
5.
Motilitas
a. Gram
positif : Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous)
b. Gram
negatif : Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus
(lophtrichous), petritrikus (petritrichous).
6. Anggota
tubuh (apendase)
a. Gram
positif : Biasanya tidak memiliki apendase
b. Gram
negatif : Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
7.
Endospora
a. Gram
positif : Beberapa grup dapat membentuk endspora
b. Gram
negatif : Tidak dapat membentuk endospora
(Tracy,
2005)
Perbedaan
relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
|
Bakteri garam
(+)
|
Bakteri
gram negatif(-)
|
Komposisi
dinding sel
|
Kandungan
lipid rendah (1-4%)
|
Kandungan
lipid tinggi
|
Ketahanan
terhadap penisilin
|
Lebih
sensitif
|
Lebih
tahan
|
Penghambatan
oleh pewarna basa (VK)
|
Lebih
dihambat
|
Kurang
dihambat
|
Kebutuhan
nutrisi
|
Kebanyakan
spesies relatif kompleks
|
Relatif
sederhana
|
Ketahanaa
terhadap
perlakuan
fisik
|
Lebih
tahan
|
Kurang
tahan
|
(Tracy, 2005)
3. Pewarnaan tahan asam
Pewarnaan ini menggunakan pewarna utama karbol fuksin. Yang memungkinkan
bakteri tahan asam terlihat berwarna merah, sementara jenis lain akan tampak
sesuai pewarna pembanding. Pewarnaan Ziehl-Neelsen menggunakan 3 jenis larutan,
yaitu ZN A, ZN B, dan ZN C. Larutan ZN A merupakan cat utama yang berupa
karbolfuksin, memberikan warna merah kepada sel bakteri. Larutan ZN B adalah
peluntur yang berupa etanol, yang melunturkan warna merah pada bakteri
tidak tahan asam, sementara warna merah pada bakteri tahan asam tidak luntur.
Larutan ZN B merupakan pewarna pembanding berupa methylen blue, sehingga bakteri
tidak tahan asam yang tadi warnanya luntur memiliki kekontrasan dengan bakteri
tahan asam. Hasil akhirnya adalah bakteri tahan asam tampak berwarna merah,
sementara bakteri tidak tahan asam berwarna biru. (Pelczar &
Chan, 2007).
4.
Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu :
pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul dan pewarnaan nucleoid
a.
Pewarnaan Spora
Spora bakteri adalah bentuk bakteri
yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari
luar.spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kristal amoeba, sebab
bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu fase
di mana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap
faktor luar yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri
merupakan tubuh dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat
resisten. Dihasilkan oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina.
Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama
banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada
beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru
dalam sitoplasma vegetatifnya yang di maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar
dan Chan, 2007).
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang
bulat panjang. Hal ini tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih
kecil ada pula yang lebih besar dari pada diameter sel induk. Letak sel di
dalam sel serta ukurannya dalam pembentukanya tidaklah sama bagai semua
spesies. Sebagai contoh beberapa spora adalah sental yang dibentuk
ditengah-tengah sel, yang kedua adalah terminal yang dibentuk diujung, ketiga
yaitu subterminal yang dibentuk di dekat ujung. Pada umumnya sporulasi
itu mudah terjadi jika keadaan medium memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai
zat-zat pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor luar lainya merugikan
tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu
oleh faktor luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan
piaraan ke medium yang baru, beberapa spesies bakteri dapat kehilangan
kemampuanya untuk membentuk spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri
apabila keadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air
meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak
karenanya keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung. Tetapi juga
dapat terjadi di tengah-tengah spora. Hal ini merupakan cirri khas bagi
beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di tengah-tengah maka
masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri
(Pelczar dan Chan, 2007).
b.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak
stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
(Tracy, 2005).
c.
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan
tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul,
karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga
memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. (Pelczar dan Chan,
2007).
d.
Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang
khusus untuk DNA (Hamid, 2010).
5.
Pewarnaan
negatif
Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar
belakang sel dengan zat warna asam, sehingga sel – sel tersebut secar kontras
tidak berwarna. Yang biasanya dipakai adalah zat warna hitam nigrosin. Metode
ini digunakan untuk sel – sel dan struktur – struktur yang sukar diwarnai
secara langsung. (Hamid, 2010).
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai berikut:
1. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan
sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan sel bakteri pada gelas
objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran) protein menjadi gugusan
reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah
terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik
atau dengan bahan kimia.
2.
Peluntur zat
warna
Peluntur zat warna berguna
untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada bayangan mikroskop. Pada
umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan
warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan
warnanya.
3.
Substrata
Merupakan zat warna asam atau
basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa tertentu. Oleh karena itu,
senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat
akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel,
maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan
sudanofil.
4.
Intensifikasi
warna
Zat warna dapat
diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat kimia yang dapat
menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena zat warna
terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu
mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan
zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan
anion zat warna asam.
5.
Zat warna
penutup atau zat warna lawan
Zat warna lawan adalah suatu
zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula yang digunakan.
Gunanya adalah untuk memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan
zat warna mula-mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan
tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna
utama.
(Pelczar
& Chan, 2007).
B. Morfologi Bakteri
Bakteri
merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk klas Schizomycetes,
berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak
berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. Cara hidup bakteri ada
yang dapat hidup bebas, parasitik, saprofitik, patogen pada manusia, hewan dan
tumbuhan. Habitatnya tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai 10 km
diatas bumi), di dalam lumpur, dan di laut. Bakteri
mempunyai bentuk dasar bulat, batang, dan lengkung. Umumnya bakteri berukuran
0,5-10 µm. (Volk dan Wheeler, 1993)
a. Bakteri bentuk bulat
Bakteri
berbentuk bulat dikenal sebagai basil. Kata basil berasal dari bacillus
yang berarti batang. Bentuk basil dapat pula dibedakan atas:
1. Basil
tunggal yaitu bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal, misalnya Salmonella
typhi, penyebab penyakit tipus.
2. Diplobasil
yaitu bakteri berbentuk batang yag bergandengan dua-dua.
3. Streptobasil
yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang membentuk rantai
misalnya Bacillus anthracis penyebab penyakit antraks.
b. Bakteri bentuk bola
Bakteri
berbentuk bola dikenal sebagai coccus, bakteri ini juga dapat dibedakan atas:
1. Monokokus,
yaitu bakteri berbentuk bola tunggal, misalnya Neisseria gonorrhoeae,
penyebab penyakit kencing nanah.
2. Diplokokus,
yaitu bakeri berbentuk bola yang bergandengan dua-dua, misalnya Diplococcus
pneumonia penyebab penyakit pneumonia atau radang paru-paru.
3. Sarkina,
yaitu bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat-empat sehngga bentuknya
mirip kubus.
4. Streptokokus,
yaitu bakteri bentuk bola yang berkelompok memanjang membentuk rantai.
5. Stafilokokus,
yaitu bakteri berbentuk bola yang berkoloni membentuk sekelompok sel tidak
teratur sehingga bentuknya mirip dompolan buah anggur.
c. Bakteri bentuk spiral
adalah
bakteri yang bengkok atau tidak lurus atau berbentuk silinder. Bakteri yang
berbentuk spiral itu tidak banyak terdapat. Spiral terbagi menjadi tiga bentuk
diantaranya :
1. Vibrio
atau bakteri koma
Batang melengkung seperti koma dan kadang membelit seperti huruf S. Mempunyai spiral yang pendek.
Batang melengkung seperti koma dan kadang membelit seperti huruf S. Mempunyai spiral yang pendek.
2. Spiril
Bentuknya seperti spiral atau seperti lilitan. Individu-individu sel yang tidak saling melekat.
Bentuknya seperti spiral atau seperti lilitan. Individu-individu sel yang tidak saling melekat.
3. Spirocheta
Bentuknya seperti spiral tetapi pergerakannya sangat aktif yang dimungkinkan karena adanya flagela yang membelit diketahui bentuk aslinya (Hamid, 2010).
Bentuknya seperti spiral tetapi pergerakannya sangat aktif yang dimungkinkan karena adanya flagela yang membelit diketahui bentuk aslinya (Hamid, 2010).
Ada tiga mcam bentuk spiral:
1. Spiral,
yaitu golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral misalnya Spirillum.
2. Vibrio,
ini dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna, misalnya Vibrio cholera
penyebab penyakit kolera.
3. Spiroseta
yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang besifat lentur. Pada saat
bergerak, tubuhnya dapa memanjang dan mengerut.
(Istamar,
2004)
Anatomi
bakteri
Bakteri tersusun atas dinding sel dan isi sel.
Disebelah luar dinding sel terdapat selubung atau kapsul. Di dalam sel bakteri
tidak terdapat membrane dalam (endomembran) dan organel bermembran seperti
kloroplas dan mitkondria. Struktur tubuh bakteri dari lapisan luar hingga
bagian dalam sel yaitu flagela, dinding sel, membrane sel, mesosom, lembaran
fotosintetik, sitoplasma, DNA, plasmid, ribosom, dan endospora. (Istamar, 2004)
a. Flagela
Flagela terdapat salah satu ujung, pada kedua ujung
atau pada perukaan sel. Fungsinya untuk bergerak. Berdasar letak dan jumlahnya,
tipe flagella dapat dibedakan menjadi montrik, amfitrik, lofotrik, dan
peritrik.Flagela terbuat dari protein yang disebut flagelin. Flagella berbetuk
seperti pembuka sumbat botol. Fungsinya adalah untuk bergerak. Flagella
berputar seperti baling-baling untuk menggerakkan bakteri. Flagela melekat pada
membrane sel. (Istamar, 2004)
b. Dinding sel
Dinding sel tersusun atas peptidoglikan yakni
polisakarida yang berikatan dengan protein. Dengan adanya dinding sel ini,
tubuh bakteri memiliki bentuk yang tetap. Fungsi dinding sel adalah untuk
melindungi sel. (Istamar, 2004)
Di sebelah luar dinding sel terdapat kapsul. Tidak
semua sel bakteri memiliki kapsul. Hanya bakteri patogen yang berkapsul. Kapsul
berfungsi untuk mempertahankan diri dari antibodi yang dihasilkan selinang.
Kapsul juga berfungdi untuk melindungi sel dari kekeringan. Kapsul bakteri
tersusun atas persenyawaan antara protein dan glikogen yaitu glikoprotein. (Istamar,
2004)
c. Membrane sel
Membrane sel tersusun atas molekul lemak dan
protein, seperti halnya membran sel organisme yang lain. Membrane sel bersifat
semipermiable dan berfungsi mengatur keluar masuknya zat keluar atau ke dalam
sel. (Istamar, 2004)
d.
Mesosom
Pada tempat tertentu terjadi penonjolan membran sel
kearah dalam atau ke sitoplasma. Tonjolan membrane ini berguna untuk
menyediakan energi atau pabrik energi bakteri. Organ sel (organel) ini disebut
mesosom. Selain itu mesosom berfungsi juga sebagai pusat pembentukan dinding
sel baru diantara kedua sel anak pada proses pembelahan. (Istamar, 2004)
e.
Lembar fotosintetik
Khusus pada bakteri berfotosintesis, terdapat
pelipatan membrane sel kearah sitoplasma. Membrn yang berlipat-lipat tersebut
berisi klorofil,dikenal sebagai lembar fotosintetik (tilakoid). Lembar
fotosintetik berfungsi untuk fotosintesis contohnya pada bakteri ungu. Bakteri
lain yang tidak berfotosintesis tidak memiliki lipatan demikian. (Istamar, 2004)
f.
Sitoplasma
Sitoplasma adalah cairan yang berada di dalam
sel (cytos = sel, plasma= cairan). Sitoplasma tersusun atas koloid yang
mengandung berbagai molekul organik seperti karbohidrat, lemak, protein,
mineral, ribosom, DNA, dan enzim-enzim. Sitoplasma merupakan tempat
berlangsungya reaksi-reaksi metabolism. (Istamar, 2004)
g. DNA
Asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid,
disingkat DNA) atau asam inti, merupakan materi genetic bakteri yang terdapat
di dalam sitoplasma. Bentuk DNA bakteri seperti kalung yang tidak berujung
pangkal. Bentuk demikian dikenal sebagai DNA sirkuler. DNA tersusun atas dua
utas polinukleotida berpilin. DNA merupakan zat pengontrol sintesis protein
bakteri, dan merupakanzat pembawa sifat atau gen. DNA ini dikenal pula sebagai
kromosom bakteri. DNA bakteri tidak tersebar di dalam sitoplasma, melainkan
terdapat pada daerah tertentu yang disebut daerah inti. Materi genetik inilah
yang dikenal sebagai inti bakteri. (Istamar, 2004)
h. Plasmid
Selain memiliki DNA kromosom, bakteri juga memiliki
DNA nonkromosom. DNA nokromosom bentuknya juga sirkuler dan terletak di luar
DNA kromosom. DNA nonkromosom sirkuler ini dikenal sebagai plasmid. Ukuran
plasmid sekitar 1/1000 kali DNA kromosom. Plasmid mengandung gen-gen tertentu
misalnya gen kebal antibiotik, gen patogen. Seperti halnya DNA yang lain,
plasmid mampu melakukan replikasi dan membentuk kopi dirinya dalam jumlah
banyak. Dalam sel bakteri dapat terbentuk 10-20 plasmid. (Istamar, 2004)
i.
Ribosom
Ribosom merupakan organel yang berfungsi dalam
sintesis protein atau sebagai pabrik protein. Bentuknya berupa butir-butir
kecil dan tidak diselubungi membran. Ribosom tersusun atas protein dan RNA. Di
dalam sel bakteri Escherichia coli terkandung 15.000 ribosom, atau
kira-kira ¼ masa sel bakteri tersebut. Ini menunjukkan bahwa ribosom memiliki
fungsi yang penting bagi bakteri. (Istamar, 2004)
j.
Endospora
Bakteri ada yang dapat membentuk endospora,
pembentukan endospora merupakan cara bakteri mengatasi kondisi lingkungan yang
tidak menguntungkan. Endospora tahan terhadap panas sehingga tidak mati oleh
proses memasak biasa. Spora mati di atas suhu 120 C. jika kondisi telah
membaik, endospora dapat tumbuh menjadi bakteri seperti sedia kala.( Istamar,
2004)
IV.
Metode
4.1 Alat
a. Obyek
glass
b. Cover
glass
c. Mikroskop
Cahaya Listrik
d. Jarum
inokulasi
e. Bunsen
f. Rak
tabung
g. Tabung
reaksi
h. Beaker
glass
i. Pipet
tetes
j. Hair
dryer
4.2 Bahan
a.
Biakan kuman Staptyloeoccus aereus
b. Gram
A : Carbol gentian violet
c. Gram
B : Iodium
d. Gram
C : Alkohol 95%
e. Gram
D : Safranin
f. Air
g. Kapas
h. Minyak
imersi
4.3
Cara kerja
a. Membersihkan
tangan dan meja dengan alkohol.
b. Diambil
obyek glass dan fiksasi dengan melidah apikan di atas Bunsen sebanyak 2 – 3
kali secara cepat.
c. Diambil
antara 1 – 2 ose biakan kuman Staptyloeoccus
aereus dan diletakkan di atas obyek glass.
d. Diratakan
biakan murni Staptyloeoccus aereus
dengan jarum ose.
e. Difiksasi
dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2 – 3 kali
dengan cepat.
f. Dituangkan
pewarna Carbol gentian violet, biarkan 1 menit.
g. Dibuang
sisa Carbol gentian violet.
h. Dicuci
preparat dengan air mengalir.
i. Dikering
preparat dengan menggunakan hair dryer.
j. Dituangkan
pewarna Iodium, biarkan selama 2 menit.
k. Dibuang
sisa Iodium.
l. Dicuci
preparat dengan air mengalir.
m. Dikeringkan
preparat menggunakan hair dryer.
n. Dipucatkan
dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan sampai warna ungu hilang.
o. Dibilas
dengan air mengalir.
p. Dituangkan
pewarna Safranin sebagai warna penutup atau pembanding biarkan selama 30 detik.
q. Dibuang
kelebihan Safranin.
r. Dicuci
preparat dengan air mengalir.
s. Dikeringkan
preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap.
t. Ditambahkan
minyak imersi pada preparat.
u. Mengamati
preparat di bawah mikroskop dengan pembesaran lemah kemudian pembesaran kuat
(100X).
v. Diamati
jenis dan bentuk morfologi bakteri.
V.
Hasil Praktikum
No
|
Nama
|
Gambar
|
Keterangan
|
1
|
Staphylococcus
aureus
|
- Jenis
bakteri gram positif
- Berwarna merah
muda dan ada yang sedikit biru tua
- Bentuk
: bulat
- morfologinya
stafilokokus
|
VI.
Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan perwarnaan gram pada bakteri. Pewarnaan
gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri
apakah gram positif atau gram negatif. Pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki
reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri sehingga dapat digunakan untuk membedakan
bakteri. Pewarnaan gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu
gram positif dan gram negatif.
Pada pewarnaan Gram, bakteri yang digunakan yaitu Staphyloecoccus aureus. Umur bakteri pada pewarnaan gram harus
berumur 24 jam atau 1 hari.
Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan mikroskop cahaya listrik bahwa Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua , morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan mikroskop cahaya listrik bahwa Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua , morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama
(crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur
dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel
bakteri tampak berwarna ungu.Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu karena
dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat. Namun selama praktek, hasil
warna bakteri yang kami amati berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru
tua. Perbedaan warna ini disebabkan oleh kesalahan pada proses pewarnaan dalam
tahap pengeringan preparat yang terlalu panas sehingga menghasilkan warna merah
muda dan bakteri yang seharusnya gram positif berubah menjadi bakteri gram negatif.
Staphylococcus termasuk
ke dalam bakteri gram positif. Karena menggunakan teknik pewarnaan gram,
bakteri ini memiliki peptidoglikan yang tebal, sehingga dapat mengikat cat gram
dengan kuat,sehingga disebut gram positif. karena dia termasuk dalam kelompok bakteri
gram positif, maka warna dari Staphylococcus
adalah ungu dengan warna dasar merah. Hal tersebut dikarenakan kandungan lipid
dari bakteri gram positif lebih rendah dan banyak mengandung
peptidoglikan.Karena kandungan lipidnya yang lebih rendah ,dinding sel bakteri
gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol sehingga bakteri
gram positif mempertahankan zat pewarna ungu Kristalnya.
Langkah – langkah yang dilakukan selama pewarnaan gram adalah proses
sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri dalam
praktek. Alkohol yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan
tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut
berfungsi untuk menyeterilkan atau membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan
agar mendapatkan hasil yang akurat.
Sample biakan bakteri Staptyloeoccus
aereus diambil sekitar 1 – 2 ose, diletakkan di atas obyek glass serta
diratakan dengan jarum ose. Kemudian difiksasi untuk menguapkan air sehingga
hanya akan didapatkan bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya
bakteri benar-benar melekat pada obyek glass sehingga olesan bakteri berupa
tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Proses fiksasi dengan
pemanasan biasanya di atas bunsen pada pewarnaan gram dapat menyebabkan bakteri
tersuspensi mati atau tidak produktif apabila suhu terlalu tinggi, walaupun
dapat melekatkan bakteri pada kaca preparat. Setelah itu biakan bakteri dituangi
pewarna carbol gentian vioet yang berfungsi memberikan pewarnaan pada bakteri
tersebut. Bakteri akan berwarna ungu. Penuangan carbol gentian vioet harus
merata pada seluruh area biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat
terwarnai dengan sempurna. Bakteri yang telah diwarnai dibiarkan selama 1 menit
agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin kuat. Kemudian sisa carbol gentian
vioet dan dicuci dengan air mengalir dan dikering preparat dengan hair drier.
Langkah selanjutnya, penuangan iodium kemudian didiamkan selama 2 menit.
Iodium merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi mengfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna
utama. Pemberian iodium bertujuan untuk memperkuat pengikatan warna oleh
bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang
dari sel. Iodium yang diteteskan didiamkan selama 2 menit bertujuan agar
pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Setelah itu, kaca
preparat dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang dan dikeringkan dengan
menggunakan hair drier.
Langkah selanjutnya adalah meneteskan alkohol 95 % dengan perlahan sampai
warna ungu hilang. Penetesan alkohol 95 % pada biakan bakteri untuk melakukan
penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek
Kristal ungu dan iodium. Pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu
karena mengandung peptidoglikan. Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi
pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan
membrane menurun sehingga komplek Kristal ungu dan iodium tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna
ungu. Setelah itu dibilas dengan air mengalir bertujuan agar warna dapat luntur
secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di obyek glass. Kemudian ditambahkan
safranin dengan menuangkannya dan dibiarkan selama 30 detik. Pewarna safranin merupakan
pewarna sekunder atau kontras berfungsi untuk mewarnai kembali sel – sel yang
telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan alkohol. Pewarnaan safranin
masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram
negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan
perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran
menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.Kemudian
dibuang kelebihan safranin, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringkan dengan
hair drier.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna
lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna
tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang
lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat
(efisiensi waktu).(Karmana, 2008)
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap preparat dengan menggunakan air mengalir. Pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dengan menggunakan hair drier, agar air tidak tercampur dengan reagen atau
pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, preparat
dikeringkan dan ditambahkan minyak imersi pada preparat dan diamati di bawah
mikroskop dengan pembesaran lemah baru kemudian dibesarkan dengan pembesaran
kuat ( 100X ). Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram
positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan
bakteri gram negatif.Hasil akhirnya, Staptyloeoccus
aereus merupakan bakteri gram positif yang seharusnya berwarna ungu.
Pengamatan bentuk dan jenis bakteri akan tampak jelas jika dilakukan
pewarnaan terhadap sel. Kebanyakan sel-sel bakteri tidak berwarna, sehingga
jika di lihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras.Warna
yang membedakan antara bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif yaitu
warna ungu dan merah, bakteri tersebut akan menyerap warna ungu dikatakan
sebagai Gram positif dan menyerap dominan warna merah berarti Gram negatif. Hal
itu disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel diantara keduanya. Pengamatan
Staphylococcus aureus dengan
perbesaran 100x bentuknya adalah kokus atau bulat termasuk dalam bakteri Gram
positif karena bakteri ini menyerap warna ungu dan dapat mempertahankannya
selama proses pewarnaan tersebut. Pewarnaan bakteri ini dipengaruhi
oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.
VII. Kesimpulan
Dari hasil praktikum dan pengamatan
pewarnaan gram dan morgologi bakteri dapat disimpulkan bahwa :
1. Staphylococcus aureus merupakan
bakteri gram positif karena berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua ,
morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh
bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
2. Terjadi
penyimpangan warna, Staphylococcus aureus
yang seharusnya berwarna ungu atau biru tua tapi berubah menjadi merah yang
disebabkan proses pengeringan yang terlalu lama sehingga menjadi panas.