PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI

I.              Tujuan

Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan bakteri ke dalam kelompok bakteri gram positif atau bakteri gram negatif serta menentukan morfologinya.

II.           Pendahuluan

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan spiral, serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan. Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop (Dwidjoseputro, 2005).

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan atau pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi bakteri. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Dengan metode pengecatan gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa safranin.

Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Karmana, 2008).Berdasarkan hal tersebut maka dilakukanlah agar praktikan dapat memahami dan melakukan pewarnaan gram terhadap suatu jenis bakteri; mengidentifikasi suatu jenis bakteri gram positif atau gram negatif; dan mengamati bentuk bakteri.

III.        Tinjauan Pustaka

A.  Pewarnaan Gram

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil,  bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. (Pelczar dan Chan, 2007).

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. (Pelczar & Chan, 2007).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. (Pelczar & Chan, 2007).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.(Volk dan Wheeler, 1993)

Macam-Macam Pewarnaan

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :

1.    Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan zat warna yang tunggal  bertujuan untuk mengindentifikasi morfologi sel bakteri. Pada pewarnaan ini zat warna yang kami gunakan adalah gentiana violet.Biasanya bakteri maupuin sekitarnya akan mempunyai warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna sederhana yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi salah satu diantaranya zat warna berikut : Lembayung gentian, lembayung safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin bara yang lainnya. (Pelczar & Chan, 2007)

a.    Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin. (Pelczar & Chan, 2007)

b.  Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. (Pelczar & Chan, 2007)

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik). (Pelczar & Chan, 2007)

2.    Pewarnaan differensial

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram. Pewarnaan gram atau metode gram adalah  salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk  membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini  dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar dan Chan, 2007).

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

a.    Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

b.   Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit  10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

c.    Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

d.   Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

e.    Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

f.    Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

(Pelczar dan Chan, 2007)

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

a.    Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

b.   Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

c.    Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

d.   Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

e.    Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

f.    Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

(Pelczar dan Chan, 2007)

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

a.       Zat warna utama (violet kristal)

b.      Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.

c.       Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

d.      Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol. (Pelczar dan Chan, 2007)

Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif  pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan menunjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas dinding sel meningkat. Dengan demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selanjutnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dengan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yang menjadi tempat pertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Karmana, 2008)

Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, alkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Pelczar & Chan, 2007).

Perbandingan Karakteristik Gram positif dan Gram negatif

1.    Dinding sel

a.    Gram positif : Homogen dan tebal (20-80 nm) serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.

b.   Gram negatif : Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dam dan luar, serta adanya membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan lipopolisakarida

2.    Bentuk sel

a.    Gram positif : Bulat, batang atau filamen

b.   Gram negatif : Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand koma, heliks atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul

3.    Reproduksi

a.    Gram positif : Pembelahan biner

b.    Gram negatif : Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan

4.    Metabolisme

a.    Gram positif : kemoorganoheterotrof

b.    Gram negatif : Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof

5.    Motilitas

a.    Gram positif : Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous)

b.    Gram negatif : Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous).

6.    Anggota tubuh (apendase)

a.    Gram positif : Biasanya tidak memiliki apendase

b.    Gram negatif : Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai

7.    Endospora

a.    Gram positif : Beberapa grup dapat membentuk endspora

b.    Gram negatif : Tidak dapat membentuk endospora

(Tracy, 2005)

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat	Bakteri garam (+)	Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah (1-4%)	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies relatif kompleks	Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

(Tracy, 2005)

3.    Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan ini menggunakan pewarna utama karbol fuksin. Yang memungkinkan bakteri tahan asam terlihat berwarna merah, sementara jenis lain akan tampak sesuai pewarna pembanding. Pewarnaan Ziehl-Neelsen menggunakan 3 jenis larutan, yaitu ZN A, ZN B, dan ZN C. Larutan ZN A merupakan cat utama yang berupa karbolfuksin, memberikan warna merah kepada sel bakteri. Larutan ZN B adalah   peluntur yang berupa etanol, yang melunturkan warna merah pada bakteri tidak tahan asam, sementara warna merah pada bakteri tahan asam tidak luntur. Larutan ZN B merupakan pewarna pembanding berupa methylen blue, sehingga bakteri tidak tahan asam yang tadi warnanya luntur memiliki kekontrasan dengan bakteri tahan asam. Hasil akhirnya adalah bakteri tahan asam tampak berwarna merah, sementara bakteri tidak tahan asam berwarna biru. (Pelczar & Chan, 2007).

4.    Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora,  pewarnaan kapsul dan pewarnaan nucleoid

a.    Pewarnaan Spora

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri  terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kristal amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu fase di mana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan tubuh dinding  yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang di maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar dan Chan, 2007).

Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih besar dari pada diameter sel induk. Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam pembentukanya  tidaklah sama bagai semua spesies. Sebagai contoh beberapa spora adalah sental yang dibentuk ditengah-tengah sel, yang kedua adalah terminal yang dibentuk diujung, ketiga yaitu  subterminal yang dibentuk di dekat ujung. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai zat-zat pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor luar lainya merugikan tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru, beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuanya untuk membentuk spora-spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya  keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora. Hal ini merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di tengah-tengah maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri (Pelczar dan Chan, 2007).

b.   Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. (Tracy, 2005).

c.    Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. (Pelczar dan Chan, 2007).

d.    Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Hamid, 2010).

5.    Pewarnaan negatif

Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar belakang sel dengan zat warna asam, sehingga sel – sel tersebut secar kontras tidak berwarna. Yang biasanya dipakai adalah zat warna hitam nigrosin. Metode ini digunakan untuk sel – sel dan struktur – struktur yang sukar diwarnai secara langsung. (Hamid, 2010).

Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai berikut:

1.    Fiksasi

Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH₃⁺) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik atau dengan bahan kimia.

2.    Peluntur zat warna

Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan warnanya.

3.    Substrata

Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat, lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil, basodill dan sudanofil.

4.    Intensifikasi warna

Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.

5.    Zat warna penutup atau zat warna lawan

Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama.

(Pelczar & Chan, 2007).

B.  Morfologi Bakteri

Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk klas Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. Cara hidup bakteri ada yang dapat hidup bebas, parasitik, saprofitik, patogen pada manusia, hewan dan tumbuhan. Habitatnya tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai 10 km diatas bumi), di dalam lumpur, dan di laut. Bakteri mempunyai bentuk dasar bulat, batang, dan lengkung. Umumnya bakteri berukuran 0,5-10 µm. (Volk dan Wheeler, 1993)

a.  Bakteri bentuk bulat

Bakteri berbentuk bulat dikenal sebagai basil. Kata basil berasal dari bacillus yang berarti batang. Bentuk basil dapat pula dibedakan atas:

1.  Basil tunggal yaitu bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal, misalnya Salmonella typhi, penyebab penyakit tipus.

2.  Diplobasil yaitu bakteri berbentuk batang yag bergandengan dua-dua.

3.  Streptobasil yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang membentuk rantai misalnya Bacillus anthracis penyebab penyakit antraks.

b. Bakteri bentuk bola

Bakteri berbentuk bola dikenal sebagai coccus, bakteri ini juga dapat dibedakan atas:

1.    Monokokus, yaitu bakteri berbentuk bola tunggal, misalnya Neisseria gonorrhoeae, penyebab penyakit kencing nanah.

2.    Diplokokus, yaitu bakeri berbentuk bola yang bergandengan dua-dua, misalnya Diplococcus pneumonia penyebab penyakit pneumonia atau radang paru-paru.

3.    Sarkina, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat-empat sehngga bentuknya mirip kubus.

4.    Streptokokus, yaitu bakteri bentuk bola yang berkelompok memanjang membentuk rantai.

5.    Stafilokokus, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkoloni membentuk sekelompok sel tidak teratur sehingga bentuknya mirip dompolan buah anggur.

c.  Bakteri bentuk spiral

adalah bakteri yang bengkok atau tidak lurus atau berbentuk silinder. Bakteri yang berbentuk spiral itu tidak banyak terdapat. Spiral terbagi menjadi tiga bentuk diantaranya :

1.      Vibrio atau bakteri koma
Batang melengkung seperti koma dan kadang membelit seperti huruf S. Mempunyai spiral yang pendek.

2.      Spiril
Bentuknya seperti spiral atau seperti lilitan. Individu-individu sel yang tidak saling melekat.

3.      Spirocheta
Bentuknya seperti spiral tetapi pergerakannya sangat aktif yang dimungkinkan karena adanya flagela yang membelit diketahui bentuk aslinya (Hamid, 2010).

Ada tiga mcam bentuk spiral:

1.    Spiral, yaitu golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral misalnya Spirillum.

2.    Vibrio, ini dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna, misalnya Vibrio cholera penyebab penyakit kolera.

3.    Spiroseta  yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang besifat lentur. Pada saat bergerak, tubuhnya dapa memanjang dan mengerut.

(Istamar, 2004)

Anatomi bakteri

Bakteri tersusun atas dinding sel dan isi sel. Disebelah luar dinding sel terdapat selubung atau kapsul. Di dalam sel bakteri tidak terdapat membrane dalam (endomembran) dan organel bermembran seperti kloroplas dan mitkondria. Struktur tubuh bakteri dari lapisan luar hingga bagian dalam sel yaitu flagela, dinding sel, membrane sel, mesosom, lembaran fotosintetik, sitoplasma, DNA, plasmid, ribosom, dan endospora. (Istamar, 2004)

a. Flagela

Flagela terdapat salah satu ujung, pada kedua ujung atau pada perukaan sel. Fungsinya untuk bergerak. Berdasar letak dan jumlahnya, tipe flagella dapat dibedakan menjadi montrik, amfitrik, lofotrik, dan peritrik.Flagela terbuat dari protein yang disebut flagelin. Flagella berbetuk seperti pembuka sumbat botol. Fungsinya adalah untuk bergerak. Flagella berputar seperti baling-baling untuk menggerakkan bakteri. Flagela melekat pada membrane sel. (Istamar, 2004)

b. Dinding sel

Dinding sel tersusun atas peptidoglikan yakni polisakarida yang berikatan dengan protein. Dengan adanya dinding sel ini, tubuh bakteri memiliki bentuk yang tetap. Fungsi dinding sel adalah untuk melindungi sel. (Istamar, 2004)

Di sebelah luar dinding sel terdapat kapsul. Tidak semua sel bakteri memiliki kapsul. Hanya bakteri patogen yang berkapsul. Kapsul berfungsi untuk mempertahankan diri dari antibodi yang dihasilkan selinang. Kapsul juga berfungdi untuk melindungi sel dari kekeringan. Kapsul bakteri tersusun atas persenyawaan antara protein dan glikogen yaitu glikoprotein. (Istamar, 2004)

c. Membrane sel

Membrane sel tersusun atas molekul lemak dan protein, seperti halnya membran sel organisme yang lain. Membrane sel bersifat semipermiable dan berfungsi mengatur keluar masuknya zat keluar atau ke dalam sel.  (Istamar, 2004)

d. Mesosom

Pada tempat tertentu terjadi penonjolan membran sel kearah dalam atau ke sitoplasma. Tonjolan membrane ini berguna untuk menyediakan energi atau pabrik energi bakteri. Organ sel (organel) ini disebut mesosom. Selain itu mesosom berfungsi juga sebagai pusat pembentukan dinding sel baru diantara kedua sel anak pada proses pembelahan. (Istamar, 2004)

e. Lembar fotosintetik

Khusus pada bakteri berfotosintesis, terdapat pelipatan membrane sel kearah sitoplasma. Membrn yang berlipat-lipat tersebut berisi klorofil,dikenal sebagai lembar fotosintetik (tilakoid). Lembar fotosintetik berfungsi untuk fotosintesis contohnya pada bakteri ungu. Bakteri lain yang tidak berfotosintesis tidak memiliki lipatan demikian. (Istamar, 2004)

f.  Sitoplasma

Sitoplasma adalah  cairan yang berada di dalam sel (cytos = sel, plasma= cairan). Sitoplasma tersusun atas koloid yang mengandung berbagai molekul organik seperti karbohidrat, lemak, protein, mineral, ribosom, DNA, dan enzim-enzim. Sitoplasma merupakan tempat berlangsungya reaksi-reaksi metabolism. (Istamar, 2004)

g.  DNA

Asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid, disingkat DNA) atau asam inti, merupakan materi genetic bakteri yang terdapat di dalam sitoplasma. Bentuk DNA bakteri seperti kalung yang tidak berujung pangkal. Bentuk demikian dikenal sebagai DNA sirkuler. DNA tersusun atas dua utas polinukleotida berpilin. DNA merupakan zat pengontrol sintesis protein bakteri, dan merupakanzat pembawa sifat atau gen. DNA ini dikenal pula sebagai kromosom bakteri. DNA bakteri tidak tersebar di dalam sitoplasma, melainkan terdapat pada daerah tertentu yang disebut daerah inti. Materi genetik inilah yang dikenal sebagai inti bakteri. (Istamar, 2004)

h.  Plasmid

Selain memiliki DNA kromosom, bakteri juga memiliki DNA nonkromosom. DNA nokromosom bentuknya juga sirkuler dan terletak di luar DNA kromosom. DNA nonkromosom sirkuler ini dikenal sebagai plasmid. Ukuran plasmid sekitar 1/1000 kali DNA kromosom. Plasmid mengandung gen-gen tertentu misalnya gen kebal antibiotik, gen patogen. Seperti halnya DNA yang lain, plasmid mampu melakukan replikasi dan membentuk kopi dirinya dalam jumlah banyak. Dalam sel bakteri dapat terbentuk 10-20 plasmid. (Istamar, 2004)

i.   Ribosom

Ribosom merupakan organel yang berfungsi dalam sintesis protein atau sebagai pabrik protein. Bentuknya berupa butir-butir kecil dan tidak diselubungi membran. Ribosom tersusun atas protein dan RNA. Di dalam sel bakteri Escherichia coli terkandung 15.000 ribosom, atau kira-kira ¼ masa sel bakteri tersebut. Ini menunjukkan bahwa ribosom memiliki fungsi yang penting bagi bakteri. (Istamar, 2004)

j.   Endospora

Bakteri ada yang dapat membentuk endospora, pembentukan endospora merupakan cara bakteri mengatasi kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan. Endospora tahan terhadap panas sehingga tidak mati oleh proses memasak biasa. Spora mati di atas suhu 120 C. jika kondisi telah membaik, endospora dapat tumbuh menjadi bakteri seperti sedia kala.( Istamar, 2004)

IV.        Metode

4.1    Alat

a.    Obyek glass

b.    Cover glass

c.    Mikroskop Cahaya Listrik

d.   Jarum inokulasi

e.    Bunsen

f.     Rak tabung

g.    Tabung reaksi

h.    Beaker glass

i.      Pipet tetes

j.      Hair dryer

4.2    Bahan

a.    Biakan kuman Staptyloeoccus aereus

b.    Gram A : Carbol gentian violet

c.    Gram B : Iodium

d.   Gram C : Alkohol 95%

e.    Gram D : Safranin

f.     Air

g.    Kapas

h.    Minyak imersi

4.3    Cara kerja

a.    Membersihkan tangan dan meja dengan alkohol.

b.    Diambil obyek glass dan fiksasi dengan melidah apikan di atas Bunsen sebanyak 2 – 3 kali secara cepat.

c.    Diambil antara 1 – 2 ose biakan kuman Staptyloeoccus aereus dan diletakkan di atas obyek glass.

d.   Diratakan biakan murni Staptyloeoccus aereus dengan jarum ose.

e.    Difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2 – 3 kali dengan cepat.

f.     Dituangkan pewarna Carbol gentian violet, biarkan 1 menit.

g.    Dibuang sisa Carbol gentian violet.

h.    Dicuci preparat dengan air mengalir.

i.      Dikering preparat dengan menggunakan hair dryer.

j.      Dituangkan pewarna Iodium, biarkan selama 2 menit.

k.    Dibuang sisa Iodium.

l.      Dicuci preparat dengan air mengalir.

m.  Dikeringkan preparat menggunakan hair dryer.

n.    Dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan sampai warna ungu hilang.

o.    Dibilas dengan air mengalir.

p.    Dituangkan pewarna Safranin sebagai warna penutup atau pembanding biarkan selama 30 detik.

q.    Dibuang kelebihan Safranin.

r.     Dicuci preparat dengan air mengalir.

s.     Dikeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap.

t.     Ditambahkan minyak imersi pada preparat.

u.    Mengamati preparat di bawah mikroskop dengan pembesaran lemah kemudian pembesaran kuat (100X).  

v.    Diamati jenis dan bentuk morfologi bakteri.

V.           Hasil Praktikum

No	Nama	Gambar	Keterangan
1	Staphylococcus aureus		-       Jenis bakteri gram positif -       Berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua -       Bentuk : bulat -       morfologinya stafilokokus

VI.        Pembahasan

Pada praktikum kali ini, dilakukan perwarnaan gram pada bakteri. Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif. Pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri sehingga dapat digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu gram positif dan gram negatif.

Pada pewarnaan Gram, bakteri yang digunakan yaitu Staphyloecoccus aureus. Umur bakteri pada pewarnaan gram harus berumur 24 jam atau 1 hari.
Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan mikroskop cahaya listrik bahwa Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua , morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.

Bakteri garam positif  ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat. Namun selama praktek, hasil warna bakteri yang kami amati berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua. Perbedaan warna ini disebabkan oleh kesalahan pada proses pewarnaan dalam tahap pengeringan preparat yang terlalu panas sehingga menghasilkan warna merah muda dan bakteri yang seharusnya gram positif berubah menjadi bakteri gram negatif.

Staphylococcus  termasuk ke dalam bakteri gram positif. Karena menggunakan teknik pewarnaan gram, bakteri ini memiliki peptidoglikan yang tebal, sehingga dapat mengikat cat gram dengan kuat,sehingga disebut gram positif. karena dia termasuk dalam kelompok bakteri gram positif, maka warna dari Staphylococcus  adalah ungu dengan warna dasar merah. Hal tersebut dikarenakan kandungan lipid dari bakteri gram positif lebih rendah dan banyak mengandung peptidoglikan.Karena kandungan lipidnya yang lebih rendah ,dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol sehingga bakteri gram positif mempertahankan zat pewarna ungu Kristalnya.

Langkah – langkah yang dilakukan selama pewarnaan gram adalah proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri dalam praktek. Alkohol yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk menyeterilkan atau membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan hasil yang akurat.

Sample biakan bakteri Staptyloeoccus aereus diambil sekitar 1 – 2 ose, diletakkan di atas obyek glass serta diratakan dengan jarum ose. Kemudian difiksasi untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapatkan bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada obyek glass sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Proses fiksasi dengan pemanasan biasanya di atas bunsen pada pewarnaan gram dapat menyebabkan bakteri tersuspensi mati atau tidak produktif apabila suhu terlalu tinggi, walaupun dapat melekatkan bakteri pada kaca preparat. Setelah itu biakan bakteri dituangi pewarna carbol gentian vioet yang berfungsi memberikan pewarnaan pada bakteri tersebut. Bakteri akan berwarna ungu. Penuangan carbol gentian vioet harus merata pada seluruh area biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat terwarnai dengan sempurna. Bakteri yang telah diwarnai dibiarkan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin kuat. Kemudian sisa carbol gentian vioet dan dicuci dengan air mengalir dan dikering preparat dengan hair drier.

Langkah selanjutnya, penuangan iodium kemudian didiamkan selama 2 menit. Iodium merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi mengfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodium bertujuan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodium yang diteteskan didiamkan selama 2 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Setelah itu, kaca preparat dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang dan dikeringkan dengan menggunakan hair drier.

Langkah selanjutnya adalah meneteskan alkohol 95 % dengan perlahan sampai warna ungu hilang. Penetesan alkohol 95 % pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek Kristal ungu dan iodium. Pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung peptidoglikan. Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga komplek Kristal ungu dan iodium  tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna ungu. Setelah itu dibilas dengan air mengalir bertujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di obyek glass. Kemudian ditambahkan safranin dengan menuangkannya dan dibiarkan selama 30 detik. Pewarna safranin merupakan pewarna sekunder atau kontras berfungsi untuk mewarnai kembali sel – sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan alkohol. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.Kemudian dibuang kelebihan safranin, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringkan dengan hair drier.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).(Karmana, 2008)

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap preparat dengan menggunakan air mengalir. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dengan menggunakan hair drier, agar air tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, preparat dikeringkan dan ditambahkan minyak imersi pada preparat dan diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran lemah baru kemudian dibesarkan dengan pembesaran kuat ( 100X ). Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.Hasil akhirnya, Staptyloeoccus aereus merupakan bakteri gram positif yang seharusnya berwarna ungu.

Pengamatan bentuk dan jenis bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan terhadap sel. Kebanyakan sel-sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika di lihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras.Warna yang membedakan antara bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif yaitu warna ungu dan merah, bakteri tersebut akan menyerap warna ungu dikatakan sebagai Gram positif dan menyerap dominan warna merah berarti Gram negatif. Hal itu disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel diantara keduanya. Pengamatan Staphylococcus aureus dengan perbesaran 100x bentuknya adalah kokus atau bulat termasuk dalam bakteri Gram positif karena bakteri ini menyerap warna ungu dan dapat mempertahankannya selama proses pewarnaan tersebut. Pewarnaan bakteri ini dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.

VII.     Kesimpulan

Dari hasil praktikum dan pengamatan pewarnaan gram dan morgologi bakteri dapat disimpulkan bahwa :

1.    Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua , morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.

2.    Terjadi penyimpangan warna, Staphylococcus aureus yang seharusnya berwarna ungu atau biru tua tapi berubah menjadi merah yang disebabkan proses pengeringan yang terlalu lama sehingga menjadi panas.