ISOLASI MIKROORGANISME

I.         Tujuan

Memahami dan mengetahui berbagai macam cara isolasi mikroorganisme baik pada agar tegak, agar miring maupun agar cawan.

II.      Pendahuluan

Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat baktri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah di mengerti jenis- jenis nutrien yang disyaratkan bakteri dan juga macam ligkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar, 1986).

Isolasi adalah kegiatan untuk memisahkan bakteri yang diinginkan dengan bakteri pengkontaminan. Tahapan awal untuk isolasi adalah inokulasi. Inokulasi adalah tahapan penanaman bakteri yang akan dikembangkan kedalam media. Penanaman ini dapat menggunakan jarum ose. Alat yang digunakan harus steril, sehingga benar-benar isolat murni yang didapat.

Oleh karena itu praktikum ini dilakukan agar praktikan dapat mengetahui dan mengerti cara mengisolasi pertumbuhan mikroba dengan cara yang benar dan aseptis dan dapat mempelajari pertumbuhan mikroba.

III.   Tinjauan Pustaka

Air merupakan komponen esensial bagi kehidupan jasad hidup. Akan tetapi dapat juga merupakan suatu substansia yang membawa malapetaka, karena air dapat membawa mikroorganisme patogen dan zat-zat kimia yang bersifat racun (Tarigan, 1988).

Faktor-faktor biotis (dalam hal ini mikroba) yang terdapat di dalam air,
menurut Suriawiria (1985) terdiri dari:

1.Bakteri

2.Fungi (jamur)

3.Mikroalga

4.Protozoa

5.Virus

Mikroorganisme apathogen (misal Escherichia coli) maupun pathogen sering dijumpai di perairan terbuka (sungai) yang digunakan secara umum oleh masyarakat. Di banyak tempat PDAM mengandalkan air sungai sebagai sumber bahan baku air minum.(Esapmsi, 2012)

Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapang dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di lingkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).

Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1990).

Untuk meumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel (inokulum) dipindahkan (diinokulasi) kedalam media dengan perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian dari biakan. Pada waktu inokulasi, jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harus dipijarkan diatas api  segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindah (Sutedjo, 1997).

Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan suatu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam -macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat karena dalam padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Mulyani, 1991).

Terdapat beberapa mikroorganisme memerlukan keadaan yang sangat khusus, misalnya tidak ada O2 sama sekali (kondisi anaerob), sedikit O2 (microaerofilik), mutlak ada O2 (aerob), ada/tidak ada O2 (fakultatif).

Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) :

1.      Metode cawan gores

Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores.

2.      Metode cawan tuang

Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan – cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi.

Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja.Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu (Admin, 2008) :

1.    Isolasi pada agar cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang. Metode gores kuadran ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel.Metode agar tuang, berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50^oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan atau di dalam cawan.

2.    Isolasi pada medium cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

3.    Isolasi sel tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

Untuk menumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel (inokulum) dipindahkan (diinokulasi) ke dalam media dengan perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian dari biakan . Dalam waktu inokulasi harus dipijarkan di atas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindah . Bagian jarum yang dipanaskan tidak terbatas pada bagian ujungnya saja tetapi termasuk pula bagian bawahnya (Mulyono, 1992).

Seperti semua bentuk kehidupan lain, mikroba membutuhkan zat-zat hara dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Pertama-tama media harus mangandung senyawa-senyawa hara yang penting untuk pertumbuhan mikroba. Disamping itu media harus juga memberikan lingkungan yang cocok bagi pertumbuhan seperti pH, tekanan osmosis, oksigen dan lain-lain. Pada umumnya semua media untuk pertumbuhan mikroba terdapat dalam dua bentuk yaitu media cair (Broth Media) dan media Padat (Solid Media) (Mulyani, 1991).

Sifat-sifat umum suatu koloni:

a.       Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya berupa suatu titik, ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium.

b.      Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang, ada tepi yang rata, ada tepinya yang tidak rata.

c.       Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata  saja dengan permukaan medium, ada pula yang timbul, yaitu menjulung tebal diatas permukaan medium.

d.      Halus-kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaanya halus saja, ada yang permukaanya kasar tidak rata.

e.       Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaanya mengkilat, ada yang permukaanya suram.

f.       Warna. Kebanyakan koloni bakteri itu berwarna keputihan atau kekuning-kuningan, akan tetapi ada juga kolini yang kemerah-merahan, coklat, jingga, biru, hijau dan ungu.

g.      Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang lunak seperti mentega ada yang keras dan kering (Dwidjoseputro, 2005).

Populasi bakteri tumbuh sangat cepat ketika mereka ditambahkan dan disesuaikan dengan gizi dan kondisi lingkungan yang memungkinkan mereka untuk berkembang. Melalui pertumbuhan ini, berbagai jenis bakteri kadang memberi penampilan yang khas. Beberapa koloni mungkin akan berwarna, ada yang berbentuk lingkaran, sementara ada yang bentuknya tidak teratur. Karakteristik koloni (bentuk, ukuran, margin, elevasi, warna, permukaan, konsistensi) yang diistilahkan sebagai “morfologi koloni”. Morfologi koloni adalah cara para ilmuwan dapat mengidentifikasi bakteri secara makroskopis, berikut adalah beberapa macam pertumbuhan koloni berdasarkan morfologinya : (Devacurii, 2012)

1.    Pertumbuhan pada Cawan Petri

Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :

1.1  Ukuran; pinpoint/punctiform (titik)

Small (kecil)

Moderate (sedang)

Large (besar)

1.2  Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen

ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media

1.3  Bentuk :

Circular: bulat,bertepi

Irregular : tidak beraturan, bertepi

Spindle

Filamentous

Rhizoid: bentuk sseperti akar, pertumbuhan menyebar

1.4  Elevasi (ketinggian pertumbuhan koloni bakteri)

Flat: ketinggian tidak terukur, nyaris rata dengan medium

Raised: ketinggian nyata terlihat, namun rata pada seluruh permukaan

Convex: bentuk cembung seperti tetesan air

Umbonate: bentuk cembung dibagian tengah lebih menonjol

1.5  Permukaan 

Halus mengkilap

Kasar

Berkerut

Kering seperti bubuk

1.6  Margins

Entire : Tepian rata

Lobate: tepian berlekuk

Undulate: tepian bergelombang

Serrate: Tepian bergerigi

Felamentous: tepian seperti benang-benang

2.    Pertumbuhan pada Agar Miring

Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus.Ciri koloni berdasarkan bentuk:

3.    Pertumbuhan pada Agar Tegak

Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :

Ciri koloni berdasar kebutuhan O_{2 :}

4.    Pertumbuhan pada Media Cair

Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O₂

IV. Metode

4.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Pada pratikum kedua ini, kita melakukan empat percobaan tentang “ Isolasi Mikroorganisme ”yang dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 20 Maret 2014 pada pukul 07.50 – 10.20 WIB dan dilanjutkan lagi pada hari Sabtu, tanggal 22 Maret 2014 pada pukul 09.00 – 10.00 WIB di laboratorium Mikrobiologi Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Surakarta.

4.2  Alat dan Bahan

4.2.1        Alat

-    Jarum Ose

-    Bunsen

-    Tabung reaksi

-    Korek

-    Botol semprot

-    Pipet volume

-    Erlenmeyer

-    Cawan petri

4.2.2        Bahan

-  Air sungai

-  Alkohol

-  Aquades

-  Media agar ( NA, PDA, PCA )

4.3  Cara kerja

4.3.1        Isolasi pada agar tegak

Metode : Tusuk

1.      Disterilkan tangan dan meja.

2.      Dengan ose lurus diambil 1 ose sampel.

3.      Ditusukkan ose yang sudah mengandung sampel pada agar tegak sampai hampir dasar agar.

4.      Dilakukan di dekat bunsen.

5.      Diinkubasi biakan pada suhu 37⁰C selama 2 x 24 jam.

4.3.2        Isolasi pada agar miring

Metode : Gores

1.      Disterilkan tangan dan meja.

2.      Dengan ose bulat diambil 1 ose sampel.

3.      Dioleskan ose yang sudah mengandung sampel pada agar tegak sampai hampir dasar agar.

4.      Dilakukan di dekat bunsen.

5.      Diinkubasi biakan pada suhu 37⁰C selama 2 x 24 jam.

4.3.3        Isolasi pada agar cawan

Metode : Streak plate

1.      Disterilkan tangan dan meja.

2.      Diambil agar cawan yang sudah padat dan steril

3.      Diambil 1 ose sampel

4.      Digoreskan diatas agar secara zig – zag

5.      Dilakukan didekat bunsen

6.      Diinkubasi biakan pada suhu 37⁰C selama 2 x 24 jam

4.3.4    Metode :Pour plate

1.      Disterilkan tangan dan meja

2.      Diambil 1 ml sampel cair ( untuk sampel padat diambil 1 gram dan diencerkan terlebih dahulu) dan dimasukkan ke cawan petri kosong yang sudah steril

3.      Dituangkan agar cair dalam kondisi hangat (50ºC) ke cawan petri

4.      Dihomogenkan dengan cara memutar cawan petri membentuk angka 8, ke kanan dank e kiri atau ke depan dan belakang

5.      Ditunggu sampai padat

6.      Dillakukan didekat buncen

7.      Diinkubasi biakan pada suhu 37ºC selama 2x2a jam

V.      Hasil Praktikum     

VI.  Pembahasan

Pada praktikum kali ini yaitu kami melakukan isolasi mikroorganisme pada air sungai seperti yang diketahui pada tinjauan pustaka bahwa isolasi mikroorganisme adalah memisahkan suatu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam -macam mikroba. Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik-teknik di dalam pengisolasian mikroba beserta pemurniannya.  

Dalam proses isolasi praktikan harus menggunakan sarung tangan, masker dan harus mensterilkan daerah sekitar tempat pengambilan sampel dengan cara penyemprotan alkohol dan api Bunsen, hal tersebut bertujuan untuk mencegah mikroba lain ikut tertanam atau masuk dalam agar padat, sehingga yang di amati adalah benar-benar mikroba yang berasal dari air sungai.

Dari hasil praktikum pada hari Kamis, 20 Maret 2014 dengan menggunakan metode isolasi tegak, isolasi miring, spreak plate dan pour plate dapat dilihat ciri-ciri mikrobia yang tumbuh setelah diinkubasi selama 2x24 jam pada media agar padat.

a.    Isolasi tegak

Yaitu dengan menusukkan jarum inokulum pada agar padat tegak, hal ini bisa untuk menegetahui apakah mikrobia pada sampel air sungai tersebut termasuk anaerob atau aerob. Dari hasil pengamatan kelompok kami, didapat ciri – ciri bentuk mikroorganisme yaitu dalam bentuk papillate, sedangkan dilihat  ciri koloni dari kebutuhan O2 adalah termasuk fakultatif anaerob (bisa dilihat dari bentuknya yang rata dari permukaan sampai ke dasar tabung reaksi, hal tersebut menunjukakan bahwa ada tidaknya udara tidak mempengaruhi pertumbuhan mikrobia air sungai tersebut. Dari hasil pengamatan warna dari mikrobia air sungai adalah keputihan.

b.    Isolasi Miring

Yaitu menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus pada agar miring. Dari hasil praktikum kelompok kami, didapat ciri mikrobia dari segi bentuk, yaitu berbentuk beaded dan berwarna keputihan . Dibandingkan dengan hasil pada isolasi tegak, isolasi miring lebih terlihat jelas dan hampir menutupi semua permukaan agar, hal ini bisa disebabkan karena jarum inokulum yang digunakan dan juga banyaknya sampel yang di tusukkan/goreskan pada agar.

c.    Streak Plate

Yaitu dengan menggoreskan ose bulat yang telah dicelupkan ke sampel pada permukaan agar (NA) secara zig zag. Metode ini ada keuntungan dan kelemahannya, keuntungannya adalah hemat bahan dan waktu sedangkan kelemahannya adalah diperlukannya keterampilan dan pengalaman.

Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik - baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores. Hal tersebut dialami oleh kelompok kami yaitu kurangnya keterampilan dan tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan mikroorganisme yang tumbuh hanya sedikit sekali.

Hasil pengamatan pada streak plate adalah pada koloni 1: bentuk = irregular, elevasi = raised, permukaan = kasar, margins = undulate. Koloni 2 : bentuk = cireular, elevasi = raised, permukaan = halus mengkilap, margins = entrie. Warna dari mikrobia yang kami amati adalah keputihan, kepekatan dari koloni yaitu keras dan kering, dengan besar koloni berupa titik.

d.   Pour Plate

Yaitu dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Pada metode ini memerlukan waktu yang banyak namun tidak memerlukan keterampilan yang begitu berarti, hanya perlu menghomogenkan antara sampel dan agar, dengan memutar cawan petri membentuk angka 8, ke kanan dank e kiri.

Metode ini memerlukan agar yang belum padat untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri, kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Agar menyebarkan bakteri tidak hanya pada permukaannya saja melainkan sel terendam agar, sehingga mikroba dapat tumbuh pada permukaan O₂ yang kaya akan oksigen dengan baik dan sesuai dengan yang diharapkan. Pada prosedur kerja yang sudah dilakukan, yaitu kita menyiapkan cawan petri yang telah steril, serta tabung reaksi pengenceran yang akan ditanam, dan media yang padat masih cair (45°C), kemudian teteskan 1ml secara aseptis, suspensi sel ke dalam cawan kosong, lalu dituangkan media yang masih cair kecawan petri kemudian putar cawan petri dengan angka 8 untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media kemudian diinkubasi.

Dari hasil praktikum kelompok kami dengan metode pour plate ini, mikrobia yang berhasil tumbuh lebih banyak dibandingkan dengan streak plate. Ada yang terlihat jelas di permukaan agar, dan ada yang terlihat jelas di dasar agar, hal ini menandakan bahwa mikrobia yang terkandung dalam air sungai itu bersifat fakultatif anaerob. Warna yang didapat adalah keputihan, dengan kepekatan keras dan kering, dan besar koloni ada yang berupa titik ada yang menyebar hamper menutupi medium.

Dengan ciri masing-masing koloni yakni sebagai berikut: Koloni 1 : bentuk =          circular, elevasi = flat, permukaan =             halus mengkikap, margins = entrie. Koloni 2 : bentuk = irregular, elevasi = flat, permukaan = kasar, margins = lobate

VII.          Kesimpulan

Dari hasil praktikum dan pengamatan dapat disimpulkan bahwa pada agar tegak mikrobia berbentuk papillate, pada agar miring mikrobia berbentuk beaded, pada metode streak plate mikrobia berbentuk irregular dan circular elevasi raised ,permukaan kasar dan halus mengkilap, margins undulate dan entire, pada metode pour plate mikrobia berbentuk irregular dan cicrural, elevasi flat, permukaan kasar dan halus mengkilap, margins entire dan lobate.