Pemeriksaan air

I. Tujuan

Mengetahui kualitas air dengan cara mengetahui jumlah mikroorganisme berdasarkan nilai Most Probable Number (MPN) dan mengetahui jasad indikator pada masing – masing sampel air.

II. Pendahuluan

Air merupakan materi esensial bagi kehidupan makhluk hidup, karena makhluk hidup memerlukan air untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya. Secara umum fungsi air dalam tubuh setiap mikroorganisme adalah untuk melarutkan senyawa organik, menstabilkan suhu tubuh dan melangsungkan berbagai reaksi kimia tingkat seluler. Pemeriksaan air secara mikrobiologi sangat penting dilakukan karena air merupakan substansi yang sangat penting dalam menunjang kehidupan mikroorganisme yang meliputi pemeriksaan secara mikrobiologi baik secara kualitatif maupun kuantitatif dapat dipakai sebagai pengukuran derajat pencemaran (Ramona, 2007).

Pemeriksaan derajat pencemaran air secara mikrobiologi umumnya ditunjukkan dengan kehadiran bakteri indikator seperti coliform dan fecal coli (Ramona, 2007). Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik, dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktose dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35° C (Pelczar dan Chan., 2006).

Kelompok bakteri coliform antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan Citrobacter fruendii. Keberadaan bakteri ini dalam air minum juga menunjukkan adanya bakteri patogen lain, misalnya Shigella, yang bisa menyebabkan diare hingga muntaber. Jadi, bakteri coliform adalah indikator kualitas air. Semakin sedikit kandungan coliform, maka kualitas air semakin baik. (Pelczar dan Chan., 2006).

Uji kualitas air terdiri dari 3 step utama, yaitu: Uji pendugaan , Uji penguat dan Uji pelengkap. Metode pengujian yang digunakan adalah metode Most Probable Number (MPN). Dalam uji penduga di gunakan lactose broth. Tabung di nyatakan positif bila terebentuk gas sebanyak 10 % atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Jumlah tabung yang positif di hitung pada masing-masing seri. MPN penduga dapat di hitung dengan melihat table MPN 3 tabung. (Pelczar dan Chan., 2006).

Dalam uji penguat, terbentuknya gas dalam Lactose Broth tidak selalu menunjukan bakteri E.coli karena mikroba lainya mugkin juga ada yang dapat memfermentasikan laktosa dengan membentuk gas. Oleh karena itu perlu di lakukan uji penguat pada media Endo agar,dengan menggunakan jaarum ose, contoh dari tabung MPN yang menunjukan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing di inokulasikan pada Endo agar dengan cara streak plate. Semua tabung di inkubasikan pada suhu 37^oC selama 2x24 jam. Jumlah media Endo agar pada masing-masing pengenceran yang menunjukan adanya pertumbuhan Coliform, baik fekal maupun non fekal dihitung dan MPN penguat dapat di hitung dari table MPN. (Pelczar dan Chan., 2006).

Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji pelengkap untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji penguat diinokulasikan ke dalam medium Lactose Broth dan medium agar miring Nutrient Agar (NA), dengan jarum inokulasi secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 37^oC selama 2 x 24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk asam dan gas pada Lactose Broth, maka sampel positif mengandung bakteri Escherichia coli. Dari media agar miring NA dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri Escherichia coli merupakan Gram negatif berbentuk batang pendek. (Pelczar dan Chan., 2006).

Oleh karena itu melalui percobaan ini agar praktikan dapat mengetahui uji kualitas air berdasarkan jumlah mikroorganisme pada air dan dapat menentukan nilai MPN. Selain itu juga dapat mempraktikkan cara pengujian perkiraan pada air untuk mengetahui adanya jasad coliform, dapat mempraktikkan pengujian penegasan untuk membedakan mikrobia fekal dan non fekal, dan dapat pula mempraktekkan pengujian kelengkapan untuk menentukkan ada tidaknya jasad indikator kualitas air berdasarkan keberadaan bakteri E.coli.

III. Tinjauan Pustaka

AIR

Air adalah kebutuhan dasar bagi kehidupan bahkan air adalah sumber dari kehidupan itu sendiri. Secara umum fungsi air dalam tubuh setiap mikroorganisme adalah untuk melarutkan senyawa organik, menstabilkan suhu tubuh dan melangsungkan berbagai reaksi kimia tingkat seluler. Pemeriksaan air secara mikrobiologi sangat penting dilakukan karena air merupakan substansi yang sangat penting dalam menunjang kehidupan mikroorganisme yang meliputi pemeriksaan secara mikrobiologi baik secara kualitatif maupun kuantitatif dapat dipakai sebagai pengukuran derajat pencemaran (Ramona, 2007).

Air yang bersih dan berkualitas ialah air yang bebas bakteri dan racun serta mengandung berbagai jenis mineral. Air yang kita konsumsi setiap harinya yang diambil langsung dari alam biasanya sudah tercemar karena berbagai sebab baik karena pencemaran, limbah-limbah beracun dari industri atau pertanian, racun atau zat berbahaya atau karena berbagai ulah manusia.(Ranoma, 2007)

Air yang berkualitas dan higienis adalah air yang cocok untuk dikonsumsi. Syarat-syarat air minum adalah tidak berbau, berasa, berwarna, tidak mengandung logam berat dan tidak mengandung mikroorganisme yang berbahaya. Air minum merupakan air yang melalui pemrosesan atau tanpa pemrosesan yang memenuhi syarat kesehatan dan bisa diminum secara langsung. (Ranoma, 2007)

Air dari sumber alam bisa diminum oleh manusia secara langsung namun ada resiko bahwa air tersebut dicemari oleh bakteri atau zat yang berbahaya. Bakteri tersebut baru akan mati jika air dimasak hingga 100 derajat celcius namun zat berbahaya yang lain seperti logam tidak bisa dihilangkan dengan cara ini. Banyaknya pencemaran air semakin memperburuk kualitas air minum masyarakat saat ini. (Ranoma, 2007)

Untuk mendapat air minum yang berkualitas, saat ini tersedia air minum isi ulang. Air minum isi ulang banyak dijual di berbagai kota. Air isi ulang isi ada poin kelebihan dan kekurangannya yang harus diperhatikan. (Ranoma, 2007)

Kelebihan air isi ulang:

1. Harganya relatif murah seperti harga AMDK.

2. Mudah untuk mendapatkan

3. Walaupun tidak semua namun kualitas air isi ulang sudah memenuhi standar Departemen Kesehatan. Hal ini tergantung akan kualitas sanitasi, mesin dan bahan baku air.

(Ranoma, 2007)

Kekurangan air isi ulang:

1. Pengawasan dan pembinaan yang lemah membuat mutu air cenderung tidak konsisten.

2. Kemungkinan terjadi salah produksi relatif tinggi, terutama menyangkut tentang pemilihan bahan baku air, pemilihan alat dan sanitasi.

3. Aturan mengenai jasa layanan depo isi ulang tidak jelas. Hal ini menyangkut kualitas produksi sehingga perlindungan hukum secara khusus pada konsumen jika terjadi kasus tidak ada.

4. Proses untuk pengemasan hanya mengandalkan teknologi yang sederhana sehingga sering terjadi kontaminasi oleh bakteri.

(Ranoma, 2007)

Saat ini ditemukan banyak sekali sampel air minum di depo isi ulang. Bakteri yang ditemukan tidak secara langsung menimbulkan penyakit namun menunjukkan tingkat sanitasi yang rendah. Resiko bakteri patogen lain yang bisa menimbulkan gangguan kesehatan akan semakin tinggi apabila semakin tinggi tingkat kontaminasi bakteri. Keberadaan bakteri tersebut bisa disebabkan oleh sumber air yang tercemar atau pemaparan dengan radiasi sinar ultraviolet kurang memadai. (Ranoma, 2007)

Standar Air Minum, menurut standar WHO semua sampel tidak boleh mengandung E. coli dan sebaiknya juga bebas dari bakteri coliform. Standar WHO: Dalam setiap tahun, 95% dari sampel-sampel tidak boleh mengandung coliform dalam 100 ml, Tidak ada sampel yang mengandung E. coli dalam 100 ml, Tidak ada sampel yang mengandung coliform lebih dari 10 dalam 100 ml, Tidak boleh ada coliform dalam 100 ml dalam dua sampel yang berurutan (AOAC,2000).

Sesuai Permenkes Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 907/MENKES/SK/VII/2002 Tentang Syarat-Syarat dan Pengawasan Kualitas Air Minum, dipersyaratkan bahwa angka E.coli dalam air minum adalah Nol per 100 ml air harus dipenuhi.( Suriaman dan Juwita, 2008)

Sedangkan menurut baku mutu yang ditetapkan oleh Pemerintah dalam PP 82/2001 tentang Pengendalian Limbah cair menyebutkan bahwa badan air yang dimanfaatkan sebagai bahan baku air minum kandungan E. coli dalam 100 ml air tidak boleh lebih dari 10.000. Menurut salah satu penelitian (Kajian Dhani Arnantha staf peneliti Lembaga kajian Ekologi dan Konservasi Lahan Basah) jumlah E.coli dalam 100 ml air Kali Mas Surabaya mencapai 1600 milyar.( Suriaman dan Juwita, 2008)

Air yang mengandung kurang dari 1 coliform per 100 ml merupakan golongan kelas I yang berarti air tersebut sangat baik untuk dikonsumsi. Nilai coliform 1-2 per 100 ml digolongkan pada kelas II yang berarti air tersebut baik dikonsumsi. Air dengan jumlah coliform 3-10 merupakan golongan air yang termasuk kelas III dan tidak baik dikonsumsi. Sedangkan jika nilai coliform lebih dari 10 per 100 ml, maka air tersebut sudah tidak boleh dikonsumsi lagi (Suriaman dan Juwita., 2008).

Pemeriksaan mikrobiologi sangat penting dilakukan mengingat air merupakan sumber kehidupan utama bagi semua makhluk hidup. Segala macam air perlu mendapat perhatian untuk diperiksa baik secara mikrobiologi,fisik maupun kimia untuk menghindarkan air dari pencemaran. .( Suriaman dan Juwita, 2008)

Syarat bakteriologi air ditetapkan sebagai berikut :

1. Tidak boleh mengandung mikroba pathogen.

2. Tidak boleh mengandung mikrobaa pathogen terlalu banyak.

( Suriaman dan Juwita, 2008)

Pemeriksaan kualitas air secara mikrobiologi meliputi :

1. Pemeriksaan jumlah total mikroorganisme.

2. Deteksi dan enumerasi terhadap bakteri pathogen Shigella dan Salmonella terutama Escherichia coli.

3. Jumlah perkiraan terdekat bakteri coli : coli umum dan coli fekal.

(Pelczar dan Chan, 2006)

Bakteri golongan koli merupakan indicator terhadap intra bacteriaceae. Bakteri coli dapat dipakai sebagai petunjuk adanya pencemaran oleh manusia maupun hewan.Adanya bakteri coli dalam air identic dengan adanya bakteri pathogen. (Pelczar dan Chan, 2006)

METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

Metode perhitungan MPN menggunakan media cair di dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabungyang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas didalam tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas, sehingga tabung durham tersebut naik keatas. (Pelczar dan Chan, 2006)

Menurut Pelczar dan Chan (2006), keuntungan dari metoda ini adalah :

1. Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum contoh yang lebih besar dari 1,0 ml/tabung.

2. Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan.

3. Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme yang diharapkan di antara jenis-jenis lainnya yang ada dalam bahan pangan tersebut.

Kerugiannya adalah dibutuhkannya banyak ulangan untuk diperoleh hasil yang teliti dan sehubungan dengan hal tersebut banyak biaya dan waktu yang dibutuhkan untuk persiapannya. Metoda ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan (Pelczar dan Chan, 2006).

Metode Most Probable Number dilakukan dengan tahap-tahap sebagai berikut :

1. Presumtive test (test pendugaan)

2. Confirmed test (test penentu/ konfirmasi)

3. Completed test (test pelengkap)

(Pelczar dan Chan, 2006)

Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform : berbentuk batang, Gram negatif, tidak-berspora (Dwidjoseputro, 2005).

Dalam uji penduga di gunakan lactose broth. Tabung di nyatakan positif bila terebentuk gas sebanyak 10 % atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Jumlah tabung yang positif di hitung pada masing-masing seri. MPN penduga dapat di hitung dengan melihat table MPN 3 tabung.( Pelczar dan Chan, 2006)

Dalam uji penguat, terbentuknya gas dalam Lactose Broth tidak selalu menunjukkan bakteri E.coli karena mikroba lainya mugkin juga ada yang dapat memfermentasikan laktosa dengan membentuk gas. Oleh karena itu perlu di lakukan uji penguat pada media Endo agar,dengan menggunakan jaarum ose, contoh dari tabung MPN yang menunjukan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing di inokulasikan pada Endo agar dengan cara streak plate. Semua tabung di inkubasikan pada suhu 37^oC selama 2x24 jam. Jumlah media Endo agar pada masing-masing pengenceran yang menunjukan adanya pertumbuhan Coliform, baik fekal maupun non fekal dihitung dan MPN penguat dapat di hitung dari table MPN. (Pelczar dan Chan, 2006)

Metode MPN biasanya biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat. Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. (Pelczar dan Chan, 2006)

Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Pelczar dan Chan, 2006).

Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung Durham yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas (Pelczar dan Chan, 2006).

Untuk metode MPN (Most Probable Number) digunakan medium cair dalam wadah berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu tabung yang mengalami perubahan pada mediumnya baik itu berupa perubahan warna atau terbentuknya gelembung gas pada dasar tabung durham. Pada metode perhitungan MPN ini digunakan bentuk tiga seri pengenceran, yang pertama 10^-1, 10^-2, dan 10^-3. Kemudian dari hasil perubahan tersebut dicari nilai MPNnya pada tabel nilai MPN, dan untuk jumlah bakterinya maka digunakan rumus (Gobel, 2008).

Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji. Uji positif akan menghasilkan angka indeks. Angka ini disesuaikan dengan tabel MPN untuk menentukan jumlah koliform dalam sampel (Gobel, 2008).

Bakteri Coliform

Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain dengan kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda bahwa adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan koliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Keuntungan mendeteksi koliform adalah jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Coliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan produk-produk susu. Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni yang di temukan kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sampel bisa di katakan murni (Pelczar dan Chan, 2006).

Banyaknya kontaminan dalam air memerlukan standar tertentu untuk menjamin kebersihannya. Air yang terkontaminasi oleh bakteri patogen saluran cerna sangat berbahaya untuk diminum. Hal ini dapat dipastikan dengan penemuan organisme yang ada dalam tinja manusia atau hewan dan yang tidak pernah terdapat bebas di alam. Ada beberapa organisme yang termasuk kategori ini, yaitu bakteri coliform (E.coli), Enterococcus faecalis, Clostiridium sp. Di Indonesia, bakteri indikator air terkontaminasi adalah E.coli. (Pelczar dan Chan, 2006)

Beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif, sehingga diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk batang, gram negatif, tidak-berspora. Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indicator keberadaan bakteri patogenik lainnya. Lebih tepatnya, sebenarnya bakteri coliform fecal adalah bakteri indicator adanya pencemaran bakteri pathogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri pathogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Pelczar dan Chan, 2006).

Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Pelczar dan Chan, 2006).

Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting bagi kualitas air minum. Kelompok bakteri coliform, antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan Citrobacter fruendi. Keberadaan bakteri di dalam air minum itu menunjukkan tingkat sanitasi rendah. Keberadaan bakteri ini juga menunjukkan adanya bakteri pathogen lain misalnya, Shigella, yang menyebabkan diare hingga muntaber (Lim, 1998).Jadi, coliform adalah indikator kualitas air. Makin sedikit kandungan coliform, artinya, kualitas air semakin baik.( Gobel,2008).

Terdapatnya bakteri coliform dalam air minum dapat menjadi indikasi kemungkinan besar adanya organisme patogen lainnya. Bakteri coliform dibedakan menjadi 2 tipe, yaitu faecal coliform dan non faecal coloform. Menurut Gobel (2008), bakteri coliform dapat dibedakan menjadi dua bagian, yaitu:

1) Coliform fekal, misalnya E. coli, merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia. Adanya E.coli pada air minum menandakan air tersebut telah terkontaminasi feses manusia dan mungkin juga mengandung patogen usus.

2) Coliform non-fekal, misalnya E. aeroginosa, biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman yang telah mati.

E.coli adalah bagian dari faecal coliform. Keberadaan E. coli dalam air dapat menjadi indikator adanya pencemaran air oleh tinja. E. coli digunakan sebagai indikator pemeriksaan kualitas bakteriologis secara universal dalam analisis dengan alasan:

a. E. coli secara normal hanya ditemukan di saluran pencernaan manusia (sebagai flora normal) atau hewan mamalia, atau bahan yang telah terkontaminasi dengan tinja manusia atau hewan; jarang sekali ditemukan dalam air dengan kualitas kebersihan yang tinggi,

b. E. coli mudah diperiksa di laboratorium dan sensitivitasnya tinggi jika pemeriksaan dilakukan dengan benar,

c. Bila dalam air tersebut ditemukan E. coli, maka air tersebut dianggap berbahaya bagi penggunaan domestik,

d. Ada kemungkinan bakteri enterik patogen yang lain dapat ditemukan bersama-sama dengan E. coli dalam air tersebut.

(Pelczar dan Chan, 2006)

Bakteri pembusuk ini dimasukkan ke dalam golongan bakteri Coliform, salah satu yang termasuk didalamnya adalah Escherichia coli. Bakteri coliform ini menghasilkan zat ethionine yang pada penelitian menyebabkan kanker. Bakteri-bakteri pembusuk ini juga memproduksi bermacam-macam racun seperti Indole, skatole yang dapat menimbulkan penyakit bila berlebih didalam tubuh (Pelczar dan Chan, 2006).

Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Krisna, 2005).

Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia. Oleh karena itu, dikenal juga dengan istilah koli tinja, sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanam-tanaman yang telah mati. Bakteri Escherechia coli merupakan mikroorganisme normal yang terdapat dalam kotoran manusia, baik sehat maupun sakit. Dalam satu gram kotoran manusia terdapat sekitar seratus juta bakteri E. coli. Bakteri berasal dari kata “Bakterion” (Yunani = batang kecil). Berdasarkan Klasifikasi, bakteri digolongkan dalam Divisio Schizomycetes. Escherichia coli (E. coli ) adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif, ditemukan oleh Theodor Escherich (tahun 1885). Hidup pada tinja dan menyebabkan masalah kesehatan pada manusia, seperti diare, muntaber serta masalah pencernaan lainnya. Bakteri ini banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. Hal ini disebabkan karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. (Krisna, 2005)

Secara garis besar klasifikasi bakteri E.coli , berasal dari Filum Proteobacteria, Kelas Gamma Proteobacteria, Ordo Enterobacteriales, Familia Enterobacteriaceae, Genus Escherichia, Spesies Escherichia coli. Secara morfologi E.coli merupakan kuman berbentuk batang pendek, gemuk, berukuran 2,4 µ x 0,4 sampai 0,7 µ , Gram-negatif, tak bersimpai , Bergerak aktif dan tidak berspora. (Krisna, 2005)

IV. Metode

A. Alat dan Bahan

1. Bahan

a. Air isi ulang

b. Laktosa Broth (LB) 0,5%

c. Alkohol 70%

d. BGLB (Briliant Green Lactosa Broth)

e. Endo Agar

f. NA Miring

g. Aquades

h. Gram A (kristal violet)

i. Gram B (mordan)

j. Gram C (aseton alkohol)

k. Gram D (safranin)

2. Alat

a. Minyak imersi

b. Cawan petri

c. Jarum ose

d. Inkubator

e. Bunsen

f. Korek api

g. Semprotan alkohol

h. Rak tabung reaksi

i. Tabung durham

j. Pipet volume

k. Objek glass

l. Mikroskop Cahaya Listrik

m. Kapas

n. Glasfirn pupm

o. Beaker glass

p. Pipet tetes

q. Hair dryer

B. Cara Kerja

1. Uji perkiraan

a. Menyerilkan tangan dan meja.

b. Menyiapkan sampel air (air isi ulang) secara steril kemudian dihomogenkan dengan mengocoknya sebanyak 25 kali.

c. Memasukkan masing – masing 10 ml air isi ulang ke dalam 3 tabung reaksi yang masing – masing berisi 10 ml Laktosa Broth.

d. Memasukkan masing – masing 1 ml air isi ulang ke dalam 3 tabung reaksi yang masing – masing berisi 10 ml Laktosa Broth.

e. Memasukkan masing – masing 0,1 ml air isi ulang ke dalam 3 tabung reaksi yang masing – masing berisi 10 ml Laktosa Broth.

f. Diinkubasi semua tabung pada suhu 37 ⁰C selama 2X24 jam.

g. Mengamati terbentuknya gas tiap 24 jam.

h. Mencatat jumlah tabung reaksi yang terbentuk gas (positif terbentuk gas) pada tiap seri tabung (10 ml, 1 ml, 0,1 ml)

i. Menentukan nilai MPN.

2. Uji Penegasan

a. Menyerilkan tangan dan meja.

b. Semua tabung reaksi yang positif terdapat gas diambil sebanyak 1 ose kemudian ditanam di media Briliant Green Lactosa Broth dan diinkubasi 2X24 jam pada suhu 37 ⁰C.

c. Mengamati hasil yang positif terbentuk gas kemudian diambil 1 ose dan ditanam di media Endo Agar dengan teknik streak plate.

d. Diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 2X24 jam.

e. Mengamati adanya koloni tipikal (merah tua atau hijau metalik).

3. Uji Lengkap

a. Diinokulasi medium Laktosa Broth dengan koloni tipikal.

b. Membuat piaran NA miring dari koloni tipikal.

c. Semua diinkubasi selama 2X24 jam pada suhu 37 ⁰C.

d. Mengamati terbentuknya gas pada media Laktosa Broth.

e. Melakukan pewarnaan gram dari piaran NA miring.

1) Membersihkan tangan dan meja dengan alkohol.

2) Mengambil obyek glass dan fiksasi dengan melidah apikan di atas Bunsen sebanyak 2 – 3 kali secara cepat.

3) Mengambil antara 1 piaran NA miring dan diletakkan di atas obyek glass.

4) Meratakannya dengan jarum ose.

5) Mefiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2 – 3 kali dengan cepat.

6) Menuangkan pewarna gram A (Carbol gentian violet), biarkan 1 menit.

7) Membuang sisa Carbol gentian violet.

8) Mencuci preparat dengan air mengalir.

9) Mengeringkan preparat dengan menggunakan hair dryer.

10) Menuangkan pewarna Gram B (Mordan), biarkan selama 2 menit.

11) Membuang sisa Iodium.

12) Mencuci preparat dengan air mengalir.

13) Mengeringkan preparat menggunakan hair dryer.

14) Dipucatkan dengan pewarnaan Gram C (aseton alkohol) dengan cara meneteskan perlahan sampai warna ungu hilang.

15) Membilas dengan air mengalir.

16) Menuangkan pewarna Gram D (safranin) sebagai warna penutup atau pembanding biarkan selama 30 detik.

17) Membuang kelebihan Safranin.

18) Mencuci preparat dengan air mengalir.

19) Mekeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap.

20) menambahkan minyak imersi pada preparat.

21) Mengamati preparat di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat (100X).

22) mengamati jenis dan bentuk morfologi bakteri.

V. Hasil Praktikum

A. Pemeriksaan Air Isi Ulang

No	Jenis Uji	Hasil
No	Jenis Uji	Ya	Tidak
1	Uji duga. Pertumbuhan di media Laktosa Broth (ada gas atau tidak)	ü Ada gas
2	Uji Konfirmasi
	a. Pertumbuhan media Briliant Green Lactosa Broth.	ü Ada gas
	b. Pertumbuhan media Endo Agar 1) Typical 2) Atypical 3) Metatypical	1) Ada typical
3	Uji Lengkap
	a. Pertumbuhan media Laktosa Broth pada suhu 44,5 ⁰C	ü ada gas
	b. Pertumbuhan media NA miring 1. Bentuk batang 2. Gram negatif 3. Tidak ada spora	ü Berbentuk batang ü Gram negatif ü Tidak ada spora

B. Hasil Uji Perkiraan Air Isi Ulang.

No tabung yang positif			Nilai MPN per 100 ml
10 ml	1 ml	0,1 ml	Nilai MPN per 100 ml
3	1	1	75

C. Foto hasil pemeriksaan air isi ulang

1. Uji pendugaan air isi ulang

Larutan sampel	Gambar
10 ml
1 ml
0,1 ml

2. Uji Penegasan Air Isi Ulang

Hasil tabung reaksi yang positif terdapat gas yang ditanam di Briliant Green Lactosa Broth	10 ml (1) 10 ml (2) 10 ml (3)
Koloni typical yang tumbuh di media endo agar

3. Hasil Uji Lengkap Air Isi Ulang

Hasil tabung reaksi yang positif terdapat gas yang ditanam di Lactosa Broth pada suhu 44,5 ⁰C
Hasil media NA miring
Pewarnaan gram E.coli berbentuk batang, gram negatif dan tidak ada spora.

VI. Pembahasan

Pada praktikum kali ini, melakukan pemeriksaan air.Pemeriksaan air dilakukan untuk mengetahui apakah air tersebut layak digunakan sebagai air minum atau digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Pemeriksaan air ini menggunakan metode MPN. Metode perhitungan MPN menggunakan media cair di dalam tabung reaksiyang berisi tabung durham, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati terbentuknya gas di dalam tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas, sehingga tabung durham tersebut naik keatas. Pemeriksaan air ditunjukkan dengan adanya bakeri indikator (coliform dan fecal coliform) dengan menggunakan tiga tahapan pengujian yaitu uji dugaan, uji penetapan, dan uji pelengkap. Sampel sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam media konsentrasi ganda karena diduga akan ada lebih banyak bakteri sehingga diperlukan lebih banyak nutrisi yang diperlukan untuk menumbuhkannya.

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas air saat praktikum menggunakan coliform sebagai indikator. Kelompok Coliform mencakup bakteri yang aerobic dan anaerobic fakultatif, berbentuk batang atau basil, gram negative dan tidak membentuk spora. Coliform memfermentasikan laktosa dengan membentuk asam dan gas CO₂ dalam waktu inkubasi selama 24 jam dan diletakkan pada suhu 37ºC.

Dalam pengujian perkiraan dapat dilakukan dengan bebrapa tahap, diantaranya dengan menyiapkan sampel air isi ulang secara steril kemudian dihomogenkan dengan mengocok sebanyak 25 kali secara menual agar sampel tercampur merata.kemudian memasukkan masing 10 ml, 1 ml, dan 0,1 ml sampel air isi ulang ke dalam masing – masing tabung reaksi yang sudah berisi media laktosa broth sebanyak 10 ml. Medium LB digunakan karena medium ini berfungsi sebagai media untuk mendeteksi kehadiran Coliform dalam air dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organism Coliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk Coliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

Kemudian diinkubasi semua tabung pada suhu 37⁰C selama 2x24 jam. Setelah 2x24 jam kemudian tabung durhamnya diamati terbentuknya gas(positif terdapat gas) atau tidak pada tiap seri tabung (10 ml, 1 ml, dan 0,1 ml) dan tentukan nilai MPNnya.

Pengamatan terhadap air isi ulang menunjukkan hasil positif dalam uji dugaan coliform yang ditandai dengan adanya gas dalam tabung durham oleh karena di dalam medium LB terdapat mikroba pembentuk gas.

Menurut Fardiaz (1992), gelembung udara yang dihasilkan pada tabung durham disebabkan oleh adanya aktivitas yang respirasi mikroorganisme, sehingga dapat dilihat hasil dari respirasi mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas. Fungsi dari tabung durham sendiri sebagai media untuk menampung gas akibat metabolisme bakteri. Dan penyebab lain dari terbentuknya gas dalam tabung, diakibatkan karena kontaminasi dari udara ketika proses isolasi dalam inkubator.

Berdasarkan data yang diperoleh maka dapat dijelaskan, bahwa mikroba yang terbentuk dalam tabung reaksi memerlukan oksigen untuk hidup, sehingga mikroba tersebut tergolong ke dalam bakteri aerob, dan salah satu cara untuk mengenali adanya mikroba dapat dilihat dari terbentuknya gas pada tabung yang menandakan tabung bersifat positif.Banyaknya coliform dalam air isi ulang dapat disebabkan adanya bakteri yang dapat memfermentasi laktosa dengan membentuk gas dalam waktu 48 jam dan pada suhu 35⁰ C, seperti bakteri asam laktat dan beberapa khamir tertentu (Fardiaz S., 1992). Masih tingginya angka organisme indikator dalam air menunjukkan bahwa air tersebut telah terkontaminasi secara fecal. Proses pemurnian air yang meliputi sedimentasi, filtrasi, dan klorinasi kurang sempurna menyebabkan air terkontaminasi dengan bakteri (Lim., 1998). Tingginya angka bakteri coliform ini kemungkinan disebabkan selain karena sejak awal air tersebut telah mengandung bakteri coliform, adalah karena botol yang digunakan untuk menampung air ini kurang steril sehingga air menjadi terkontaminasi.

Pada tabung dengan volume 10 ml sebanyak 3 tabung menunjukkan hasil positif, pada tabung dengan volume 1 ml sebanyak 1 tabung, dan pada tabung dengan volume 0,1 ml sebanyak 1 tabung. Berdasarkan pencocokan seri tabung yang positif mengandung coliform dengan tabel MPN seri 3 tabung, didapatkan hasil bahwa jumlah bakteri coliform pada air isi ulang per 100 ml adalah sebanyak 75 (75 MPN/100ml). Dari hasil ini dan dibandingkan dengan pustaka, maka air isi ulang ini sudah tidak layak dikonsumsi lagi sebab mengandung coliform lebih dari 10 per 100 ml (Suriaman dan Juwita., 2008).Indeks MPN pada coliform sebesar 75 setelah dibandingkan dengan Permenkes 416 Tahun 1990 pada coloform sebesar 50 tidak memenuhi syarat yang ditetapkan, karena melebihi ketetapan yaitu sebesar 75.

Bakteri non-coliform dalam metabolismenya juga memproduksi gas (Black, 1998) maka untuk memastikan keberadaan bakteri Coliform dilakukanlah uji penetapan. Uji penetapan dilakukan mulai dari senin, 9 Juni 2014. Uji penetapan ini dilakukan dengan beberapa langkah, diantaranya dengan semua tabung reaksi yang positif terdapat gas ditanam di media BGLB (Briliant Green Lactosa Broth) dan diinkubasi 2X24 jam, 37⁰C. Kemudian diamati hasil positif yang tebentuk gas kemudian ditanam di media Endo Agar dengan teknik streak plate.

Tabung yang menunjukan hasil positif pada uji penetapan ditumbuhkan pada media BGLB (Briliant Green Lactosa Broth) yang merupakan media selektif karena kandungan emepedunya akan meningkatkan pertumbuhan bakteri gram negatif Coliform, namun kandungan hijau berliannya akan menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dengan jalan merusak dinding selnya.Pada hasil yang positif terbentuk gas setelah ditanam di media Endo Agar, tabung dengan volume 10 ml sebanyak 3 tabung menunjukkan hasil positif adanya gas. Penggunaan medium Endo Agar yang mengandung zat pewarna eosin dan metilen blue, pada bakteri gram positif campuran zat warna ini akan semakin menghambat pertumbuhan sedangkan pada Eschericia coli kedua zat warna ini akan terakumulasi pada koloninya dalam suasana asam dan akan memberikan warna kehijauan mengkilat yang khas sebagai hasil positif adanya bakteri E. coli

Cawan petri yang berisi Endo agar disiapkan, kemudian ose yang akan digunakan dicelupkan ke dalam alkohol lalu dibakar pada bunsen, lalu ditunggu beberapa saat dan ose dicelupkan ke dalam sampel dan diambil 1 ose lalu digoreskan ke dalam cawan petri yang telah berisi Endo agar.

Hasil yang positif terbentuk gas kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37⁰C. Kemudian diamati koloni typical (merah tua atau hijau metalik). Dari hasil pengamatan termasuk fecal tyipical karena berwarna hitam merah yang ada titik hitamnya dan sedikit agak hijau. Fecal typical tersebut jasad mikroorganisme yang baru terkena feses dan merupakan E. Coli.

Setelah dilakukan uji dugaan, maka dilanjutkan dengan uji konfirmasi untuk melihat adanya bakteri E. coli dalam air isi ulang. Dari hasil uji ini ada yang menunjukkan hasil positif dalam medium Endo Agar yang ditandai dengan adanya koloni yang berwarna hitam merah yang ada titik hitam dan sedikit hijau.

Uji yang terakhir ialah uji pelengkap. Setelah mengetahui hasil dari biakan yang ditanam pada endo agar, yaitu bakteri fecal maka langkah selanjutnya adalah menanam kembali biakan tersebut pada LB dengan suhu 44,5° C dan NA miring, diinkubasi selama 1x24 jam. Ditanam pada LB bertujuan untuk mengetahui apakah benar positif mengandung bakteri coliform dengan bukti adanya gelembung gas pada tabung durham yang artinya dalam sampel air tersebut positif tercemar bakteri coli fekal. Sedangkan untuk penanaman di NA miring untuk mengetahui bentuk, warna dan berspora atau tidaknya dengan menggunakan cara pengecetan gram serta pengamatan dibawah mikroskop.

Pada uji pelengkap ini dilakukan pewarnaan gram untuk mengetahui bentuk dari bakteri yang terdapat pada sampel. Prosedur pewarnaan gram yang dilakukan sama seperti pewarnaan gram yang telah dilakukan sebelumnya. Adapun fungsi-fungsi penambahan warna pada pewarnaan bakteri gram yaitu, pewarna Kristal ungu ditambahkan sebagai pemberi warna awal, mordan ditambahkan untuk memperkuat ikatan pada dinding sel sehingga warna yang dilihat dapat terlihat lebih jelas, aseton alkohol ditambahkan sehingga pada bakteri gram negatif yang mengandung peptidoglikan. Safranin ditambahkan untuk memberikan kompleks warna merah pada bakteri gram negatif sehingga bakteri gram negatif menjadi berwarna merah sedangkan pada bakteri gram positif pewarna safranin tidak berpengaruh sehingga bakteri gram positif tetap berwarna ungu. Setelah dilakukan pewarnaan gram dan diamati pada mikroskop, bakteri yang teramati yaitu bakteri berbentuk basil dan berwarna merah muda sehingga dapat dikatakan terdapat bakteri E.Colli. Kemudian diamati pada mikroskop lalu dilihat warna dan bentuk bakterinya. Dari hasil pengamatan, jenis bakterinya adalah E.coli yang berbentuk batang, gram negatif dan tidak ada spora. Hal tersebut menandakan bahwa sampel air isi ulang tersebut tidak layak dikonsumsi.

VII. Kesimpulan

Dari hasil praktikum pemeriksaan air pada air isi ulang dapat disimpulkan bahwa :

1. Jumlah bakteri Coliform pada sampel air isi ulang adalah 75/100 ml. Kualitas air pada sampel yang diuji adalah tidak layak digunakan sebagai air minum sebab jumlah coliformnya sangat banyak sehingga akan berbahaya bila diminum.

2. Jenis bakteri yang mencemari sampel air isi ulang adalah berasal dari bakteri coliform,terdapat pencemaran akibat adanya bakteri Escherichia coli dengan ciri – ciri berbentuk batang, gram negatif dan tidak berspora.